关于生物指示剂

范文1:关于生物指示剂

关于生物指示剂

blueski推荐[201022]出处:来自网上作者:不详

生物指示剂系一类特殊的活微生物制品。可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。

(一)制备生物指示剂用微生物的基本要求

不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂,制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性:①菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染微生物的耐受性;②菌种应无致病性;③菌株应稳定。存活期长,易于保存;④易于培养。若使用休眠孢子,生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。(二)生物指示剂的制备

生物指示剂的制备应按一定的程序进行,制备前,需先确定所用微生物的特性,如D值(微生物的耐热参数,系指一定温度下,将微生物杀灭90%所需的时间,以分表示)等。菌株应用适宜的培养基进行培养。培养物应制成悬浮液,其中孢子的数量应占优势,孢子应悬浮于无营养的液体中保存。

生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子,可制成多种形式,通常是将一定数量的孢子附着在惰性的载体上,如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等;孢子悬浮液也可密封于安瓿中;有的生物指示剂还配有培养基系统。生物指示剂应选用合适的材料包装,并设定有效期。载体和包装材料在保护生物指示剂不被污染和损耗的同时,还应保证灭菌剂穿透并能与生物指示剂充分接触。载体和包装应设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。

有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。使用替代品时,应用数据证明二者的等效性。(三)生物指示剂的应用在灭菌程序的验证中,尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果,但生物指示剂的被杀灭程度,则是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。可使用市售的标准生物指示剂,也可使用由日常生产污染菌监控中分离的最耐受微生物制备的孢子。

在生物指示剂验证试验中,需确定孢子在实际灭菌条件下的耐受性,并测定孢子的纯度和数量。验证时,生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大,耐受性强,以保证灭菌程序有更大的安全性。在最终灭菌法中,生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出,分别置培养基中培养,确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。

过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平,可采用市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品,设计灭菌程序时,根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平,选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验证所获得的数据进行评估。

常用的生物指示剂

1、湿热灭菌法:湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子,如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953。D值为1.53.0min,每片(或每瓶)活孢子数5*10(5)5*10(6)个,在121℃、19min下应被完全杀灭。此外,还可使用生孢梭菌孢子如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955,D值为0.40.8min。2、干热灭菌法:干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子,如NCIMB8058、ATCC9372。D值大于1.5min,每片活孢子数5*10(5)5*10(6)个。去热原验证时使用大肠杆菌内毒素,加量不小于1000细菌内毒素单位。3、辐射灭菌法:辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子,如NCTC10327、NCIM10692、ATCC27142。每片活孢子数10(5)*10(6),置于放射剂量25kGy条件下,D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程,但不能用于灭菌辐射剂量的建立。

4、气体灭菌法;环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子,如NCTC10073、ATCC9372。气态过氧化氢灭菌最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子,如NCTC10007、NCIM8157、ATCC7953。每片活孢子数1*10(5)5*10(6)个。环氧乙烷灭菌中,枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min,在环氧乙烷浓度为600mg/l,相对湿度为60%,温度为54℃下灭菌,60min应被杀灭。5、过滤除茵法:过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(如ATCC19146),用于滤膜孔径为0.22um的滤器;黏质沙雷菌(ATCC14756),用于滤膜孔径为0.45um的滤器。

范文2:生物指示剂相关参考资料

保证产品无菌是注射剂产品质量保证的核心问题。无菌生产工艺是保障注射剂产品无菌的关键手段。而只有经过充分验证后的灭菌(无菌)生产工艺,才能保证生产出无菌的产品。微生物挑战试验是无菌生产工艺验证的重要环节。而选择适当的生物指示剂则是微生物挑战试验结果获得认可的关键。本文将围绕如何为终端灭菌工艺(过度杀灭和残存概率法)选择适当的生物指示剂进行讨论。灭菌是指杀灭所有形式微生物的过程。在业界,常用“无菌保证水平”(Sterility Assurance Level,SAL)概念来评价灭菌(无菌)工艺的效果,SAL的定义为产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。该值越小,表明产品中微生物存在的概率越小。为了保证注射剂的无菌安全性,国际上一致规定,采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6,即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。生物指示剂就是为了保证整个灭菌过程达到SAL 水平而应用的,它能综合反映影响灭菌效果的各种因素。因此为了保证验证结果的重复性,生物指示剂应当采用标准化的菌株(即变异性小,各项生物学特征均一性好的菌种),并且应当具备合乎要求的抗力。更重要的是,参照USP的要求“It must be established that the biological indicator system provides a challenge to the sterilization process that exceeds the challenge of the natural microbial burden in or on the product.”,我们应当选择比现有生产线自然环境下所发现的菌株更难杀灭的菌株来作为生物指示剂。举例来说,比如通过对现有车间环境,生产线,人员,物料两年的的连续观测,发现在现有生产条件下所发现的菌株的D值最高不超过0.8,则选择D值在0.8~1.5之间的生孢梭菌( Clostridium sporogenes;ATCC7955)为生物指示剂进行验证就是不合适的。而如果在现有生产条件下所发现的菌株的D值最高不超过0.6,则可以选择生孢梭菌为生物指示剂。只要满足以上两个原则(标准化菌株及合乎要求的抗力),生产企业可以自行选择、研究、培养生物指示剂(前提是提供充分的生产环境和验证菌株的研究资料);也可以选择商用的生物指示剂产品,如Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)、Clostridium Sporogenes(生孢梭菌)、Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌)、Bacillus coagulans(凝结芽孢杆菌)等菌种的孢子。不论采用何种验证菌株,参照USP,对湿热灭菌(121℃)的工艺验证用菌株均应证明“具备合乎要求的抗力”;通常应满足以下要求:D值在1.5~3.0之间;存活时间在4.5~14.0min之间;完全杀灭时间在13.5~32.0min之间。为了表征菌株的“抗力”,可参照USP<55> BIOLOGICAL INDICATORSRESISTANCE PERFORMANCE TESTS的相关标准化程序,测定D值、存活时间和杀灭时间,并提交相关的验证资料。但在大多数情况下,在申报新药时国内企业缺乏对车间环境,生产线,人员,物料连续两年的检测资料。在这种情况下企业不能自行选择“新”的生物指示剂,而应当选择为目前业界熟知的一些生物指示剂。美国NIH 首先(1955年)使用嗜热脂肪芽孢杆菌制备生物指示剂,因为该菌的孢子无致病性、无热原、无毒,而且,对压力蒸汽的抵抗力在大多数微生物中最强。目前,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(ATCC 7953)已成为验证湿热灭菌程序的最常用的生物指示剂。采用该菌株进行灭菌工艺验证通常不再需要企业提供连续两年的微生物环境监测结果。验证过程通常为将一定量已知耐热性的孢子接入产品中,用设定的灭菌程序灭菌,以确认设定的灭菌工艺是否符合标准。然而有的产品可能会增加微生物的耐热性,有的产品可能会杀灭微生物或与之不相容,在后一种情况下,可考虑用生理盐水或与产品相似的溶液替代产品进行验证试验。所以研究灭菌程序之前,必须了解生物指示剂在产品或替代产品中的耐热性。即参照USP<55>的要求对D值进行测定。其中规定“The requirements of the test are met if the determined D value is within 20% of the labeled D value for the selected sterilizing temperature and if the confidence limits of the estimate are within 10% of the determined D value.”。即测定的D值应该为标定值的80~120%(置信区间为10%以内)。此外,企业有责任对购买的指示剂产品的纯度和分类学特征进行研究,至少应当确定该微生物的“种”;并详细说明供应商提供的菌种的D值范围、适用的灭菌条件、存储条件、出厂时间、过期时间、菌种稳定性等资料。当该生物指示剂存储时间较长或者拟进行验证的灭菌条件与生产商的说明不符时,必须重新测定指示剂的D值、存活时间和杀灭时间。在使用生物指示剂时容易忽视的一点就是所有关于满足SAL不得大于10-6的产品就是无菌产品的假设都是建立在原产品中的微生物量(bioburden,生物负荷)不超过每单位壹佰万个。因此应当检测生物指示剂每个单剂量中的微生物孢子数。参照USP要求“The requirements of the test are met if the average number of viable spores per carrier is not less than 0.3 log of the labeled spore count per carrier and does not exceed the log labeled spore count per carrier by 0.48.”;即单剂量包装中的孢子数不低于标示量的0.3Log,亦不得过标示量的0.48Log。总而言之,选择恰当的生物指示剂,执行正确的步骤,并提供系统完整的信息,才能使无菌生产工艺验证结果令人信服。

范文3:生物指示剂试验

9.6生物指示剂挑战性试验:

9.6.1验证判断标准:生物指示剂颜色变化:灭菌后保持紫蓝色,阳性对照为黄色判为合格。

9.6.2判断标准依据:压力蒸汽灭菌生物指示剂说明书。9.6.3验证方法:按照灭菌SOP进行操作。9.6.3.1生物指示剂:嗜热脂肪芽孢。

9.6.3.2使用方法:将生物指示剂编号后和被灭菌物品一起放置在灭菌器内,最冷点处放1支且包裹在被灭菌物品内,最冷点附近放2支且包裹在被灭菌物品内,冷凝水排水口附近放1支且包裹在被灭菌物品内。经压力蒸汽灭菌后,直接置于恒温培养箱中56-60℃培养24-48小时,并取另一支未经灭菌的生物指示剂一起培养,作为阳性对照。

9.6.4结果判断:根据生物指示剂颜色反应判断灭菌效果,培养后全部保持紫色为灭菌合格,若由紫蓝色变黄色则为灭菌不合格。其中有菌对照管应由紫蓝色变为黄色。9.6.5填写记录:9.6.5.1表一指示剂编号

1第一次

23 49.6.5.2表二指示剂编号

1第一次

23 49.6.5.3表三指示剂编号

灭菌前颜色

灭菌后颜色

结果评定

灭菌前颜色紫蓝色紫蓝色紫蓝色紫蓝色

灭菌后颜色

结果评定

灭菌前颜色紫蓝色紫蓝色紫蓝色紫蓝色

灭菌后颜色

结果评定

1第一次

23 49.6.5.4表四阳性对照检测人复核人评价:

紫蓝色紫蓝色紫蓝色紫蓝色

培养前:紫蓝色

培养后:黄色检测日期复核日期

评价人:日期:年月日